Пцр минусы и плюсы

Достоинства и недостатки ПЦР-диагностики

ДНК-диагностика — это один из наиболее современных высокотехнологичных методов исследования. ДНК-анализы широко применяются в диагностике инфекционных заболеваний , позволяя обнаруживать даже единичные микроорганизмы в организме человека.

ДНК-диагностика объединяет несколько методов исследования, самый распространенный из них — метод ПЦР (полимеразной цепной реакции).

ПЦР диагностика

Что такое ПЦР

ПЦР — (Polymerase chain reaction, PCR diagnostics) — расшифровывается как полимеразная цепная реакция.

ПЦР диагностика — это метод лабораторной диагностики инфекционных заболеваний, в частности, этот метод широко применяется и для диагностики ЗППП — заболеваний, передающихся половым путем.

Анализ методом ПЦР основан на обнаружении в материале исследования небольшого фрагмента ДНК возбудителя той инфекции, которую подозревает врач. «Небольшой фрагмент ДНК» — это несколько сотен пар оснований ДНК — кирпичиков, расположенных в строго определенной последовательности, и потому образующих неповторимый узор. Для ПЦР-диагностики инфекций достаточно небольшого фрагмента, поскольку любая ДНК включает в себя не менее нескольких тысяч оснований.

При проведении ПЦР-анализа ведется поиск такого фрагмента ДНК инфекции, который специфичен только для данного микроорганизма. Это значит, что этот фрагмент ДНК «особенный» — он встречается только у этого микроба (или группы родственных микробов), но не встречается ни у одного другого микроба.

Сама полимеразная цепная реакция (пцр диагностика) используется для того, чтобы найденный фрагмент размножить, клонировать: чтобы однозначно «увидеть» эти фрагменты ДНК, к окончанию реакции их должно быть не мене 10 12 штук.

История открытия ДНК и разработки метода ПЦР

Первоначально сам принцип метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) был разработан Кэри Мюллисом в 1983г. Открытие ПЦР стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние 20 лет, и за разработку ПЦР-анализа Кэрри Мюллис уже в 1993 г. был удостоен Нобелевской премии в области химии.

Появлению метода проведения полимеразной цепной реакции предшествовали определенные достижения молекулярной генетики: к тому времени уже были расшифрованы нуклеотидной последовательности геномов ряда микроорганизмов и выделены специфические.

Также появлению ПЦР много способствовало открытие уникального фермента ДНК-полимеразы (или taq-полимеразы). Именно этот фермент катализирует и «контролирует» все процессы во время проведения анализа методом ПЦР. Особенность этого фермента — он термостабилен, исключительно термостоек: он выдерживает нагревание до температуры кипения без потери активности, а «любимый» его температурный режим во время работы — 72 о С. Многие реакции при проведении ПЦР идут почти исключительно при повышенной температуре.

С момента появления метода, ПЦР-исследования завоевывают все большую и большую популярность. Врачи , лаборанты и микробиологи, без преувеличения, просто в восторге от этого метода – диагностика пцр. По словам врачей и лаборантов нашего медицинского центра «Евромедпрестиж» , ПЦР-анализ прост в исполнении, обладает непревзойденными показателями чувствительности и специфичности. Все эти показатели способствовали тому, что диагностика методом ПЦР стремительно распространилась по всему миру.

В настоящее время метод ПЦР-диагностики развивается семимильными шагами. Во всем мире совершенствуются, модифицируются и разрабатываются всевозможные модификации ПЦР-анализа. Каждый год на медицинский рынок поступает десятки новых разработок и тест-систем ПЦР-диагностики, предназначенных для выявления нуклеотидных последовательностей различных микроорганизмов — возбудителей инфекционных заболеваний. Новые разработки для проведения ДНК-исследований с каждым разом снижают себестоимость ПЦР-анализа, делая его доступным для широкого использования в диагностических и лечебных целях.

Материал для сдачи ПЦР-анализа

Материалом для проведения ПЦР-диагностики может служить:

  • соскоб эпителиальных клеток (соскоб из уретры у мужчин и у женщин, соскоб из цервикального канала)
  • кровь, плазма, сыворотка крови
  • биологические жидкости (сок простаты, плевральная, спинномозговая, околоплодная, суставная жидкости, слюна)
  • моча (используется первая порция утренней мочи)
  • мокрота
  • биопаты желудка и двенадцатиперстной кишки
  • слизь и другие биологические выделения

Как правильно подгтовиться к ПЦР-анализу (ДНК-диагностике)

Достоверность результатов лабораторной диагностики пцр зависит не только от опыта и профессионализма врача-лаборанта, возможностей данной лаборатории, но и от того, соблюдал ли пациент рекомендации врача, насколько правильной была его подготовка к проведению анализа. На самом деле ничего сложного в правильной подготовке нет. При сдаче анализа методом ПЦР врачи рекомендуют соблюдать следующие правила:

  • За сутки до проведения анализа не жить половой жизнью
  • Сдача ПЦР анализа крови проводится натощак, т. е. необходимо ничего не есть, не пить и не жевать жвачку
  • Для ПЦР-анализа мочи используется первая утренняя порция, собранная в чистый, стерильный контейнер

Срок изготовления

Результат ПЦР-диагностики обычно можно получить через 1,5—2 суток после сдачи анализа. Возможно получение результатов ПЦР-теста в течение одного дня.

Источник: www.sahapova.ru

Преимущества и недостатки метода пцр

(как метода диагностики инфекционных заболеваний):

1. Прямое определение наличия возбудителей.

Многие традиционные методы диагностики, например иммуноферментный анализ, выявляют белки-маркеры, являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции. Выявление специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции.

2. Высокая специфичность.

Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов, в отличие от метода иммуноферментного анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами.

Читать еще:  Недостаток железа симптомы у женщин

3. Высокая чувствительность.

Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. Теоретически для осуществления реакции достаточно всего одной копии искомой ДНК (РНК) -последовательности в исследуемом материале, что позволяет использовать ее даже в тех случаях, когда серологические и бактериологические исследования не дают положительного результата вследствие крайне низкого микробного титра (например при контроле инфекционной безопасности донорской крови и органов, диагностике хронических и латентных инфекций).

4. Универсальность процедуры выявления различных возбудителей.

Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. Метод основан на выявлении фрагмента ДНК или РНК, являющегося специфичным для конкретного организма. Сходство химического состава всех нуклеиновых кислот позволяет применять унифицированные методы прове­дения лабораторных исследований. Это дает возможность диагностировать несколько возбудителей из одной биопробы. В качестве исследуемого материала могут использоваться различные биологические выделения (слизь, моча, мокрота), соскобы эпителиальных клеток, кровь, сыворотка.

5. Высокая скорость получения результата анализа.

Для проведения ПЦР-анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, что занимает большое количество времени. Это особенно заметно при исследовании медленнорастущих микроорганизмов. Однако даже в случае быстрорастущих культур оперативность ПЦР может быть полезной. Например, выделение, идентификация и определение лекарственной устойчивости у штаммов метициллинрезистентного золотистого стафилококка (MRSA) с помощью традиционных микробиологических методов требуют не менее 3-5 дней, в то время как ПЦР-анализ позволяет выявить MRSA менее чем за сутки.

6. Возможность диагностики не только острых, но и вялотекущих, скрытых инфекций.

Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики труднокультивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т.д.).

Однако следует отметить, что метод ПЦР лишь дополняет спектр традиционных методов, используемых в микробиологической диагностике. Наиболее рационально и эффективно применение ПЦР для обнаружения микроорганизмов, трудно-выявляемых в лабораторных условиях, атипичных форм бактерий. К ним также относятся внутриклеточные паразиты и микроорганизмы, способные длительно существовать в организме хозяина.

Наиболее эффективно и обоснованно использование метода в урогинекологической практике – для выявления хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллеза, микоплазменной инфекции, ВПЧ-вируса папилломы человека; в пульмонологии – для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулеза; в гастроэнтерологии – для выявления геликобактериоза; в клинике инфекционных заболеваний – в качестве экспресс-метода диагностики сальмонеллеза, дифтерии, вирусных гепатитов В, С и G; в гематологии – для выявления цитомегаловирусной инфекции, онковирусов. Высокоспецифичная, чувствительная и быстрая диагностика многих тяжелых заболеваний способствует не только их эффективному лечению, но и предотвращению распространения.

В то же время экстремальная чувствительность ПЦР требует новых подходов к клинической интерпретации результатов, получаемых в лаборатории. В частности, выявление в клинических образцах сапрофитных и условно-патогенных микроорганизмов может не означать наличия патологического процесса и поэтому не может быть автоматически интерпретировано как диагноз, особенно на фоне благополучной клинической картины у пациента. По этой же причине следует с осторожностью использовать ПЦР для анализа образцов с характерным полимикробным сообществом (кал и материал, полученный из верхних дыхательных путей и гениталий).

Экстремальная чувствительность реакции ферментативной амплификации ДНК является одновременно ахиллесовой пятой технологии ПЦР. Этот парадокс известен также как проблема чувствительности ПЦР к загрязнению (контаминированию) посторонними молекулами ДНК, которые могут служить мишенью для используемого набора праймеров. Даже единичные молекулы загрязняющей ДНК могут быть многократно копированы в процессе ПЦР, приводя к образованию целевого ДНК-продукта, а следовательно, к ложноположительному результату.

Существуют разные источники ПЦР-загрязнения. Наиболее частым является контаминирование реакционной смеси ДНК-продуктами предыдущих реакций. В результате ПЦР в каждой реакционной пробирке может образовываться более миллиарда копий исходной последовательности ДНК, каждая из которых, в свою очередь, является потенциальной мишенью для последующей амплификации. В процессе анализа синтезированные фрагменты ДНК могут легко распространяться в лаборатории в виде аэрозоля (при открывании реакционных пробирок), через руки исследователей и лабораторные принадлежности, загрязняя реактивы и материалы, используемые в ПЦР, и приводя к ложноположительному результату анализа образцов, в которых исходно отсутствовала ДНК искомого возбудителя. В случае высокой концентрации микробной ДНК в исследуемом клиническом материале ПЦР-загрязнение может происходить при переносе даже небольшого количества ДНК из одного образца в другой, например, через поверхность перчаток при открывании пробирок с образцами или через приспособления, используемые для механической гомогенизации тканей.

Читать еще:  Частое мочеиспускание и зуд во влагалище

При использовании ПЦР с универсальными праймерами (см. выше) источником загрязняющей ДНК могут служить коммерческие препараты ДНК-полимераз и других реактивов, применяемых в ПЦР. В связи с опасностью получения ложноположительных результатов в лабораториях, постоянно использующих ПЦР в диагностических целях, необходимы соблюдение строгих требований и специальные подходы, направленные на снижение риска ПЦР-загрязнения.

Одним из наиболее существенных требований, предъявляемых к диагностическим ПЦР-лабораториям, является необ­ходимость разделения лаборатории на «пред-ПЦР-помещения», где осуществляются обработка образцов и приготовление реакционных смесей, и «после-ПЦР-поме­щения», где анализируются продукты реакции. Обязательными являются также раздельное хранение реактивов и материалов, используемых на разных этапах ПЦР, максимальное использование одноразовых пластиковых материалов на этапе, предшествующем амплификации, и регулярная обработка помещений ультрафиолетовым (УФ) излучением, повреждающим загрязняющие последовательности ДНК.

Дополнительные меры, обеспечивающие защиту ПЦР от загрязнения, могут включать использование ламинарных боксов для работы с образцами и приготовления ПЦР-смесей, специальные биохимические (урацилгликозилаза) и физико-химические (УФ излучение + изопсорален) методы инактивации ПЦР-продуктов. Особенно важно для оценки достоверности данных ПЦР-анализа и отсутствия ложноположительных результатов регулярное исследование отрицательных контролей (не содержащих ДНК-мишень) параллельно с клиническими образцами.

Помимо опасности получения ложноположительных результатов существует и обратная проблема, связанная со снижением чувствительности ПЦР, следствием которого являются ложноотрицательные результаты. На практике вопрос о соотношении теоретической (то есть максимально возможной) и реальной чувствительности ПЦР не всегда решается однозначно. Чувствительность ПЦР может быть снижена вследствие многих причин, наиболее важной из которых является ингибирование реакции компонентами биологических образцов.

Ингибиторы ПЦР могут присутствовать в образцах крови (гемоглобин), мокроты, мочи, биопсийном материале. Различные вещества, например часто используемые антикоагулянты (особенно гепарин) или компоненты кровяных питательных сред, могут также подавлять реакцию амплификации ДНК. Ингибирование ПЦР обычно можно выявить путем искусственного добавления ДНК-мишени к исследуемому образцу и ее последующей амплификации. Отрицательный результат, полученный с заведомо положительным контролем, может говорить о наличии ингибиторов, для устранения которых необходимо использовать разведение образца или специальные методы подготовки проб.

Серьезную проблему представляет также выбор конкретных методов подготовки клинических образцов к исследованию с помощью ПЦР. В настоящее время не существует универсальных подходов к выделению ДНК разных видов микроорганизмов из различных источников. Быстрые методы подготовки проб, предусматривающие возможность автоматизации, иногда не позволяют достичь требуемого уровня чувствительности. С другой стороны, многоэтапные методики, позволяющие очистить и сконцентрировать микробную ДНК для ПЦР-анализа, оказываются трудоемкими и могут увеличивать риск контаминирования образцов.

Наконец, ПЦР является дорогостоящей. Для ее реализации необходимо комплексное оснащение лаборатории, включая не только термоциклер и устройство для ДНК-электрофореза, но и отдельные центрифуги, холодильники, дозаторы и другое оборудование. Затраты на ПЦР включают высокую стоимость реактивов и расходуемых материалов. Поэтому только в случае выявления и исследования труднокультивируемых возбудителей ПЦР может быть сопоставима по стоимости с традиционными микробиологическими методами.

Источник: studfile.net

ПЦР-диагностика ИППП. — отзыв

Откровенно о неприятном. Как подготовиться к ПЦР и почему он так важен? Неожиданное обнаружение ВПЧ 18.

Никому не понравится такая щепетильная тема для разговора как тема про инфекции передающиеся половым путем (ИППП). Все мы сразу отнекиваемся, клянемся в своем целомудрии и божимся, что уж я то точно ничем не болею. А ты уверен? Ты уверен, что у тебя или твоего партнера ничего нет? Многие инфекции довольно долго могут протекать бессимптомно. Поэтому так важно следить за своим здоровьем и проверять его. Поможет же нам в этом такой анализ как ПЦР-диагностика.

Что это такое и как проводится?

Метод ПЦР использует принципы молекулярной биологии. Его суть заключается в применении особых ферментов, которые многократно копируют фрагменты РНК и ДНК возбудителей болезни, которые находятся в пробах биоматериала.

После этого работники лаборатории сверяют полученные фрагменты с базой данных, выявляют тип возбудителя болезни и его концентрацию.

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, охлаждающем и нагревающем пробирки с пробами биоматериала. Нагрев и охлаждение необходимы для проведения репликации. Точность температурного режима влияет на точность результата.

Если простыми словами, этот анализ помогает нам распознать половые инфекции, которые не увидишь в стандартном мазке на микрофлору.

Есть разные анализы на ПЦР-диагностику ИППП. Зависит это от количества инфекций, которые вы хотите проверить. Самый большой — ПЦР-13 содержит следующие показатели:

Так же бывает качественный и количественный анализ ПЦР. Это значит, что в первом случае просто будет ответ — обнаружено или нет, а во втором — если обнаружено, то укажут в каком количестве. Я предпочитаю сдавать сразу количественный, тем более он не намного дороже.

ЗАБОР БИОМАТЕРИАЛА И ПОДГОТОВКА К АНАЛИЗУ.

Стандартно у мужчин и женщин забор анализа делают из уретры. Это очень неприятно. После такого в течении дня болезненно ходить в туалет, возникает резкая колющая боль, но это быстро проходит.

Читать еще:  Как пить зеленина капли

Перед анализом необходимо 2-х дневное воздержание от половой жизни. За 2 часа до него нельзя мочиться.

Для женщин существует так же второй вариант сдачи — мазок из цервикального канала. Подготовка — все тоже воздержание от секса, а вот сходила ты в туалет или нет — роли не играет. Так же нельзя использовать вагинальные свечи и делать спринцевания в течении все тех же двух дней.

Еще одно важное условие — не стоит сдавать ПЦР за 5 дней до предполагаемых месячных и через несколько дней после них. В противном случае результат может быть недостоверным.

МОЯ ИСТОРИЯ .

Впервые я столкнулась с этим анализом в 2012 году, когда ни с того ни с сего начали донимать неприятные выделения с луковым запахом. Да, тема неприятная. Тогда доктор сразу что-то заподозрил и направил в лабораторию с соответствующим списком предполагаемых инфекций. Через 3 дня я уже знала результат — у меня оказалась уреаплазма. Пролечила, но на повторный мазок после полного курса лечения не пошла. Честно сказать, я просто замоталась и забыла за него. А зря! Потому что через 2 года на плановом осмотре в стандартном мазке на микрофлору обнаружили большое количество лейкоцитов. Лечили одним, потом другим, а они все не снижались. Направили на полный анализ ПЦР. И что же вы думаете? Снова уреаплазма. Видимо тогда не долечила, и она стала протекать бессимптомно. Вот почему так важно сдавать повторный анализ по истечении определенного времени после лечения, чтобы клетки успели обновиться и вы знали точно — помогло или нет. На этот раз я уже ничего не забыла и получила приятные новости — не обнаружено.

Далее следовали несколько лет затишья, и вот в прошлом году мне снова пришлось сдать полный ПЦР. Все потому что сейчас я прохожу химиотерапию, и резко начались неприятные симптомы в виде слабого жжения и сухости. Мазок снова показал просто огромное количество лейкоцитов. Мой гинеколог сказала, что это так называемый дисбактериоз влагалища, но я решила перестраховаться и сдала ПЦР-диагностику. Зачем? Была неприятная история — узнала, что бывший молодой человек мне изменял, и теперь не могла с уверенностью сказать, что я «чистенькая».

ПЦР-13 с количественным результатом обошелся мне чуть больше 3-х тысяч рублей. И вот такие результаты мне пришли через 3 дня.

Как попой чуяла!

Наличие гарднерелы говорит о дисбактериозе, то есть нарушении микрофлоры, которую мы поправили следующим лечением:

  1. Клиндацин Б Пролонг Крем — 3 дня.
  2. Затем Ацилакт — 10 дней — для восстановления микрофлоры поле местного антибиотика.

Что меня поразило больше всего, так это положительный результат на ВПЧ 18 типа. КАК?! ОТКУДА?! Раньше же его не было! Ответ неоднозначен — либо я действительно заразилась. Либо в моей ситуации может быть еще один вариант — этот вирус мог быть во мне давно, как и любой другой, но так сказать в спящем состоянии, то есть в таких малых количествах, что аппарат по ПЦР-диагностике попросту мог его не распознать. И вот когда у меня началась химия, иммунитет стал стремительно падать, на этом фоне вирус мог расплодиться.

Мой гинеколог отказывалась верить в результат анализа, потому что этот ПЦР я сдавала из уретры, а на ВПЧ 18 лучше делать из цервикального канала, потому что именно шейка матки место его обитания. Отправила пересдавать уже только на него и из цервикального канала.

На этот раз я пошла в другую лабораторию — Инвитро. Отдельно анализа на ВПЧ 18 у них не было, только в комплексе на 4 типа — ВПЧ 6, 11, 16, 18. Стоил 880 рублей.

Ну что ж, вот результаты.

Количество немного отличается, но по факту результат один — положительно.

Конечно же я его лечила и совсем скоро предстоит повторная сдача анализа. Надеюсь все будет хорошо.

Достоинства ПЦР-диагностики:

— большой охват ИППП

Недостатки:

— сдача из уретры неприятна и болезнена

— если брать полный список инфекций, стоимость все-таки не маленькая

— если инфекция в «спящем состоянии», то может быть не распознана

ПЦР-диагностика — очень важный и нужный анализ, так как многие ИППП могут протекать у вас или вашего партнера абсолютно бессимптомно. Перед сдачей анализа конечно же лучше посоветоваться с врачом, чтобы решить на что и откуда лучше его сдавать.

Всем здоровья и только хороших результатов.

  • Мой опыт с гормональной спиралью Мирена
  • Тест для определения В-гемолитического стептококка группы А — как легко и просто в домашних условиях определить наличие стрептококка
  • Быстрый помощник при простуде на губах — Зовиракс Дуо-Актив
  • Таблетки для рассасывания Доритрицин — при болях в горле № 1
  • Церукал — быстрая и качественная помощь при тошноте и рвоте

Источник: irecommend.ru

Ссылка на основную публикацию
Adblock
detector